دانلود کتاب Nanobodies y sus Aplicaciones Desarrollo de una plataforma para acelerar el descubriemiento de "nanobodies" contra blancos de interes terapeutico

Tesis de Doctorado
Director de Tesis: Dr. Gualberto González-Sapienza
Facultad de Química
Universidad de la República (No indica ciudad ni país)
Octubre 2015

Además de los anticuerpos convencionales, los camélidos poseen anticuerpos carentes de cadena
liviana en los que un único dominio forma el sitio de unión al antígeno. Este dominio, denominado
Nanobody o VHH, es uno de los fragmentos de reconocimiento de antígeno más pequeños conocidos
en la naturaleza (~15 kDa) y se caracterizan por su alta estabilidad, solubilidad y especificidad.
Estas características únicas de los VHHs junto a su facilidad de manipulación mediante biología
molecular convierten a los VHH en una prometedora alternativa a los anticuerpos convencionales o
fragmentos de anticuerpo para numerosas aplicaciones biotecnológicas.
Este trabajo de tesis tuvo como horizonte establecer tecnología local para la generación de
bibliotecas de nanobodies en fagos filamentosos a partir de linfocitos B de llamas (Lama glama).
Asimismo se desarrollaron metodologías que facilitan la selección y caracterización de los
nanobodies de interés contra una variedad de antígenos que van desde pequeñas moléculas hasta
complejas estructuras celulares. La funcionalidad de los nanobodies seleccionados se demostró en
diferentes aplicaciones biotecnológicas.
En la primera parte del trabajo se presenta el desarrollo de un vector de alto nivel de expresión y
un sistema de biotinilacion in vivo de los nanobodies que facilita el proceso de screening y
caracterización paralela de cientos de clones en forma sistematizada y rápida. El sistema tiene gran
versatilidad y facilita el estudio de la reactividad de los nanobodies mediante citometría de flujo,
ELISA, microscopía, inmunoprecipitación, etc. Como primer aplicación de este sistema se
desarrolló un método de ranqueo de afinidad relativa por el antígeno de la población de nanobodies
aislados en la etapa de selección inicial (panning) y un sistema que permite la búsqueda de pares de
nanobodies para la detección del antígeno en inmunoensayos tipo sándwich, lo que permitió el
desarrollo de un ELISA ultrasensible para la cuantificación de la epoxi-hidrolasa humana.
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En la segunda parte del trabajo se describe la preparación de una biblioteca de nanobodies
contra células dendríticas murinas, y la adaptación de la plataforma de descubrimiento de
nanobodies para aislar anticuerpos contra receptores celulares nativos utilizando células enteras para
las etapas de aislamiento y caracterización. De esta forma se aislaron anticuerpos contra el
componente CD11b del receptor Mac-1, la región no polimórfica del MHC-II y contra el receptor
CD45, constituyendo un desarrollo de gran relevancia debido a que, a diferencia de los anticuerpos
convencionales, los nanobodies pierden drásticamente la reactividad contra su antígeno ante
pequeños cambios conformacionales. Debido a eso los nanobodies seleccionados contra receptores
recombinantes inmovilizados sobre poliestireno (placa de ELISA) muy raramente reaccionan en
forma cruzada con el receptor nativo en las células. A pesar de esto último, y dada la importancia de
dirigir la selección utilizando receptores recombinantes, se mostró que la cuidadosa elección de la
forma de inmovilización del receptor recombinante, sí permite aislar nanobodies contra receptores
nativos. Esto fue demostrado seleccionando nanobodies contra la cadena CD11c del receptor CDR4
que es un marcador de células dendríticas.
Por último se realizó una prueba de concepto sobre la utilidad de los nanobodies como dominios
de funcionalización, en este caso para conferir funciones efectoras a nanobodies con capacidad de
neutralizar la toxina tetánica. Una vez aislados los nanobodies anti-toxina, se prepararon anticuerpos
biespecíficos fusionándolos a los nanobodies anti- CD11b, MHCII y CD45, y se estudió su poder de
neutralización y biodistribución in vivo, encontrando un dramático incremento del poder
neutralizante cuando los anticuerpos neutralizantes se funcionalizaron con el nanobody anti-CD11b
(que reacciona con un receptor endocítico), pero no con el anti-MHC-II o anti-CD45.